पॉलीएक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन (पेज) की उत्पादन प्रक्रिया में मुख्य रूप से जेल तैयार करना, वैद्युतकणसंचलन संचालन, धुंधलापन और परिणाम अवलोकन जैसे चरण शामिल हैं।
जेल की तैयारी पृथक्करण जेल (10%) की तैयारी: 0 मिली ddH₂O, 3 mL 30% स्टॉक जेल, 5 mL 5 mol/L ट्रिस -HCl, 1 mL 10% SDS और 1 mL 10% AP मिलाएं, तली को सील करने के लिए 10 μL TEMED डालें, और फिर 4 μL TEMED डालें और अच्छी तरह मिलाएँ। इस मिश्रण को कांच की प्लेटों के बीच डालें, ऊपर से पानी से सील करें और जेल के पूरी तरह से पोलीमराइज़ होने के लिए 30-60 मिनट तक प्रतीक्षा करें।
स्टैकिंग जेल (4%) तैयारी: 4 मिली डीडीएच₂O, 33 मिली 30% स्टॉक जेल, 25 एमएल 1 मोल/एल ट्रिस -एचसीएल, 0.2 मिली 10% एसडीएस और 0.2 मिली 10% एपी मिलाएं, 2 μL TEMED मिलाएं और तुरंत अच्छी तरह मिलाएं। पृथक्करण जेल पर पानी डालें, इस मिश्रण को डालें, और तुरंत कांच की प्लेटों के बीच कंघी डालें, स्टैकिंग जेल के पूरी तरह से पोलीमराइज़ होने के लिए 15-30 मिनट तक प्रतीक्षा करें।
वैद्युतकणसंचलन ऑपरेशन नमूना उपचार: नमूने को 2XSDS लोडिंग बफर की समान मात्रा के साथ मिलाएं, 3{6}}5 मिनट के लिए 100 डिग्री पर गर्म करें, और फिर 1 मिनट के लिए 12,000 आरपीएम पर सेंट्रीफ्यूज करें, और एसडीएस-पेज विश्लेषण के लिए सतह पर तैरनेवाला लें।
लोड हो रहा है: 10 μL प्रेरित और अप्रेरित नमूने लें और उन्हें नमूना पूल में जोड़ें, और नियंत्रण के रूप में 20 μL कम आणविक भार प्रोटीन मानकों को जोड़ें।
इलेक्ट्रोफोरेसिस: इलेक्ट्रोफोरेसिस टैंक में 1X इलेक्ट्रोफोरेसिस बफर जोड़ें, बिजली की आपूर्ति कनेक्ट करें, स्टैकिंग जेल के वोल्टेज को 60V पर बनाए रखें, और पृथक्करण जेल के वोल्टेज को 100V पर बनाए रखें। जब ब्रोमोफेनॉल नीला वैद्युतकणसंचलन टैंक के नीचे तक पहुंच जाए, तो वैद्युतकणसंचलन बंद कर दें (लगभग 3 घंटे)।
धुंधलापन और परिणाम अवलोकन
धुंधलापन: कांच की प्लेट से जेल निकालें और इसे कमरे के तापमान पर 4 से 6 घंटे के लिए कूमासी ब्रिलियंट ब्लू स्टेनिंग घोल से दाग दें। डिस्टेनिंग: दाग वाले जेल को डिस्टेनिंग घोल में रखें और इसे कई बार डिस्टेनिंग करें जब तक कि प्रोटीन बैंड स्पष्ट रूप से दिखाई न दे। परिणामों का अवलोकन: डिस्टेनिंग के बाद, जेल की तस्वीर खींची जा सकती है और उसे बचाया जा सकता है। डेस्टेनिंग चरण पूरा होने के बाद, फोटोग्राफी के लिए जेल को इमेज प्रोसेसिंग सिस्टम के नीचे रखें और परिणामों को फ्लॉपी डिस्क में सहेजें।